碱基编辑技术的发展令人瞩目，在不到十年时间里，从实验室走向临床，用于治疗衰弱性疾病或绝症，但它仍然是一项相对较新的技术，当碱基编辑不仅编辑了目标核苷酸碱基，还编辑了周围的碱基时，难免会发生一种非预期编辑的脱靶或被称为”旁观者编辑（bystander  edit）” 的情况 – – 在基因编辑（如CRISPR-Cas9）或药物治疗中，工具或药物被错误地作用于非目标位点，导致基因组意外改变或出现药物不良反应的现象。

由加州大学圣地亚哥分校生物化学与分子生物物理系副教授Alexis Komor（题图中间者）领导的实验室开发了一种以最大限度减少脱靶效应的方法，并将此研究成果发表在《自然·生物技术》杂志上。

碱基编辑技术的原理是对单链DNA进行编辑。以腺嘌呤碱基编辑器（ABE）为例，它可以将目标腺嘌呤（A）碱基编辑为鸟嘌呤。然而，如果目标碱基周围存在多个A碱基，有时即使只有一个A碱基，所有A碱基也会被编辑。这些旁观者编辑可能无害或“无声”，但也可能带来不良后果，包括细胞死亡。

降低旁观者编辑的一种方法是缩小“编辑窗口”，即ABE能够有效编辑的碱基范围。然而，研究表明，缩小编辑窗口通常也会降低目标编辑的效率。Komor希望开发一种方法，既能降低旁观者编辑的发生率，又能保持目标编辑的效率。

“尤其对于治疗应用而言，优化这两种特性都非常重要。基因组编辑器可能在导入所需编辑方面非常高效，但如果它同时导入其他不必要的编辑，那么用作治疗手段就不安全了，”她说道。

ABE 8 变体展现出更高的编辑效率，但编辑窗口也更大。ABE7.10 则相反：编辑窗口更小，但效率更低。ME-ABE 则在两者之间取得了平衡，既拥有较小的编辑窗口，又具备较高的编辑效率。

在这项工作中，化学系校友、曾任Komor实验室博士后研究员的Mallory Evanoff 将注意力集中在ABE的初始版本ABE7.10上。ABE7.10的编辑窗口比最近开发的ABE8.20和ABE8e编辑器更窄，但编辑效率也更低。ABE 8系列变体具有更高的靶向编辑效率，因此应用更广泛（包括临床试验），但它们的旁观者编辑率也更高。Mallory Evanoff 希望兼顾两者的优点。

为了将A碱基转化为G碱基，ABE7.10使用了一种经过基因工程改造的酶，该酶引入了14个点突变，这些突变此前已被证实对有效的碱基编辑至关重要。引入和筛选这些重要突变的过程（一种被称为定向进化的技术，该技术荣获2018年诺贝尔化学奖）是在大肠杆菌细胞中完成的，并且其操作方式使得人们无法明确这14个突变各自对编辑活性的具体贡献。

为了厘清这些影响，Evanoff 采用了回复突变分析法，将每个突变体回复到其原始的“野生型”序列。然后，她分别在人类细胞和大肠杆菌细胞中对所有14个单独回复突变体的活性进行了表征。

她注意到，虽然有些突变在细菌中表现相似，但另一些突变在两种宿主系统中却产生了截然不同的影响。鉴于大多数研究人员使用ABE是在人类细胞中，Evanoff 筛选出了五个突变，这些突变单独逆转后，要么对人类细​​胞没有影响，要么增强了编辑活性。然后，她将这五个突变组合在一起，创建了她称之为最小进化ABE（ME-ABE）的突变体。

由此产生的 ME-ABE 保持了较窄的编辑窗口，但获得了与两种更常用的 ABE 8 变体类似的编辑活性。

“这是我们首次能够将效率和编辑窗口的特性解耦。以往的研究表明，提高编辑活性总是会以扩大编辑窗口为代价，从而导致更多的旁观者编辑，”Komor说道。“我们很高兴能将这个工具提供给学术界，帮助那些想要模拟或纠正突变，但目标A碱基附近存在不可接受的旁观者碱基的研究人员。”

任何两个人之间都可能存在数百万种基因变异，虽然其中许多是无害的，但有些却会导致严重的甚至致命的遗传疾病。找出导致疾病的突变或突变组合就像医学侦探工作一样，但一旦成功，科学家就能为个体患者开发精准的基因疗法。

“构建这些精准工具的意义在于，我们可以将这些突变引入模式生物，并在对患者进行任何治疗之前提出正确的问题，” Evanoff 说。“或者，我们可以非常具体地分析这样一个事实：许多人可能携带大量突变，但只有少数突变会导致我们正在研究的症状或疾病。”

ME-ABE（ABE7.10-HK 和 ABE7.10-HRHSK）能够对ERRC2基因中的特定靶点 A 进行精确建模，该靶点 A 的突变与多种癌症相关。ME-ABE 可最大限度地减少旁观者编辑，因此与现有编辑器相比，它们更适合进行精准编辑。

她称 ME-ABE 为“双刃剑”工具，因为它既能帮助研究人员更好地模拟和理解可能的基因突变，又能让他们实施潜在的纠正措施，并构建能够治愈特定疾病的个性化药物。

Komor 和 Evanoff 致力于开发新的碱基编辑器——特别是通过在哺乳动物细胞而不是细菌中进化它们——他们也希望 ME-ABE 能成为其他寻求开发有效基因编辑工具的研究人员的起点。

“从事工具开发工作的一大好处就是，你创造出的东西能够帮助其他人找到他们自己问题的答案，” Evanoff说。“这些工具将提供给那些对特定疾病或特定系统非常了解的研究人员，让他们能够模拟治疗方案。”

研究作者为加州大学圣地亚哥分校的 Alexis Komor、 Mallory Evanoff、Sanjana Korpal、Zachary D. Krill、Quinn T. Cowan 。

本研究由美国国立卫生研究院（2R35GM138317、T32 GM007240-41、T32 GM008326 和 T32 GM145427）资助。

来源：加大圣地亚哥分校

（美国华文网编发）